苏丹红检测试剂盒（ELISA）

苏丹红检测试剂盒（ELISA）

（酶联免疫法）

1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测番茄酱、辣椒酱、蛋等样本中的苏丹红（Sudan，SUD），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的苏丹红和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗苏丹红抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含苏丹红含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中苏丹红的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.3ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 检测下限：

番茄汁/番茄酱/辣椒酱………………12ppb

辣椒粉(辣椒面）/饲料………………120ppb

蛋类(鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋）……………30ppb

2.4 交叉反应率：

苏丹红…………………………………100%

对位红…………………………………123%

罗丹明…………………………………8%

 2.5 样本回收率：

番茄汁/番茄酱/辣椒酱…………80% ±15%

辣椒粉(辣椒面）/饲料…………95% ±15%

蛋类(鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋）………80% ±15%

3 试剂盒组成

主要成分

标准品浓度依次为: 0ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb、24.3ppb

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：甲醇

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：10%甲醇

    取10ml甲醇加入90ml去离子水中，混匀，密闭备用。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 番茄汁/番茄酱/辣椒酱

1）称取2±0.05g均质样品于离心管中，加入10ml甲醇，振荡5min，室温下4000r/min以上离心10min；

2）取100µl上清液与700µl去离子水混匀；

3）取50µl用于分析。  

    样本稀释倍数：40    检测下限：12ppb

5.3.2 辣椒粉、饲料

1） 称取1±0.05g样本于离心管中，加入10ml甲醇，震荡5min，室温下4000r/min以上离心10min；

2）取20µl上清液与780µl 10%甲醇混匀；

3）取50µl液体用于分析。

    样本稀释倍数:400    检测下限：120ppb  

5.3.3 蛋类(鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋）

1）用均质器低速均质蛋类样本（熟蛋取样蛋黄，生蛋取样全蛋）；

2）称取1±0.05g均质后蛋类样本于离心管中，加入9ml甲醇，振荡5min（剧烈振荡，将成团样本振散开并充分混匀），15℃下4000r/min以上离心10min；

3）取100µl上清液与900µl去离子水混匀；

4）取50ul用于分析。

    样本稀释倍数:100    检测下限：30ppb  

备注：如样品严重污染、较多杂质或残留物严重超标，应进

一步稀释后重新分析。

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前需配制：

1）用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。

2）配制标准品应用液；低浓度的标准品不稳定，需现配现用。

在0ppb的瓶中加10%甲醇3ml，0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb的瓶中分别加10%甲醇2ml，24.3ppb的瓶中加10%甲醇2.93ml。

标准液6：取1.0ppm高浓度标准品溶液73ul加入装有2.93ml 10%甲醇的24.3ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为24.3ppb。

标准液5：取1ml标准液6加入装有2ml 10%甲醇的8.1ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为8.1ppb。

标准液4：取1ml标准液5加入装有2ml 10%甲醇的2.7ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为2.7ppb。

标准液3：取1ml标准液4加入装有2ml 10%甲醇的0.9ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.9ppb。

标准液2：取1ml标准液3加入装有2ml 10%甲醇的0.3ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.3ppb。

标准液1：直接使用10%甲醇的，浓度即为0ppb。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。

6.3 洗    涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，最后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。

6.5 洗    涤：同上

6.6 显    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

6.7 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。