仅供科研使用，不得用于临床检验

黄曲霉毒素总残检测试剂盒（ELISA）

（酶联免疫法）

1 原理及用途

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物，主要污染玉米、花生、坚果等。黄曲霉毒素以 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2 这四种毒素为主，黄曲霉毒素总量一般是指这四种毒素的总量。它们是 I 类致癌物，被证明对人和动物的肝脏、肾脏等组织和器官具有很大的危害，是一类毒性很强的致癌物质。

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测谷物、花生、饲料等样品中的黄曲霉毒素，试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的黄曲霉毒素和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.02ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～15min

2.3 检测下限：

谷物……………………………………0.1ppb

配合饲料………………………………0.2ppb

食用油、花生…………………………0.2ppb

酱类、麦类等饲料……………………0.2ppb

啤酒……………………………………0.2ppb

葡萄酒、酱油、醋……………………0.1ppb

2.4 交叉反应率：

黄曲霉毒素B1…………………………100%

黄曲霉毒素B2…………………………80%

黄曲霉毒素G1…………………………75%

黄曲霉毒素G2…………………………45%

黄曲霉毒素M1…………………………8%

 2.5 样本回收率：

谷物及配合饲料……………………85%±15%

花生…………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

酱类、麦类等饲料………………83±15%

啤酒………………………………84±15%

葡萄酒、酱油、醋………………87±15%

3 试剂盒组成

主要成分

标准品浓度依次为: 0ppb、0.02ppb、0.04ppb、0.08ppb、0.16ppb、0.32ppb

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：甲醇、正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷 

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：样本提取液

    70%甲醇，即V甲醇:V去离子水=7：3。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 谷物处理方法 

1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加5ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：5    检测下限：0.1ppb

5.3.2 配合饲料处理方法 

1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加10ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：10    检测下限：0.2ppb

（若样本中黄曲霉毒素含量较高，可取2）步骤中已混匀的液体，以35%甲醇进行稀释，此时样本稀释倍数则为实际稀释倍数。例如：取2）步骤中液体以35%甲醇10倍稀释，实际稀释倍数为10×10=100，检测下限：2ppb）

5.3.3 食用油、花生、高油脂的饲料处理方法

1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加8ml正己烷和10ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）去除上层液体，取0.5ml下层液体加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：10    检测下限：0.2ppb

5.3.4 酱类、麦类、饼干、糕点等食品或调料，以及饲料浓缩料等饲料处理方法

1）称取2g粉碎样品于50ml离心管中，加10ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取2ml上清，加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

3）转移上层液体到另一容器中，下层液留置备用，向上层液中再加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），充分振荡混5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

4）去除上层液体，合并两次的下层液体并充分混匀；

5）取合并后的下层液体2ml于50-60℃氮气下吹干；

6）加入0.5ml样品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去离子水混匀；

7）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：10    检测下限：0.2ppb

5.3.5 啤酒处理方法

1）将啤酒充分搅拌（去除CO2），取2ml啤酒样品，加入1ml蒸馏水，再加入7ml甲醇，振荡5分钟；

2）取混匀后的样品液0.5ml加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：10    检测下限：0.2ppb

5.3.6 葡萄酒、酱油、醋处理方法

1）取2ml样品，加入2ml蒸馏水，再加入10ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取下层液体1ml于50-60℃氮气下吹干；

3）加入0.5ml样品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去离子水，混匀；

5）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：5    检测下限：0.1ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

6.5 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。